Принцип проточной цитометрии
Проточная цитометрия — это метод, позволяющий в режиме реального времени анализировать и сортировать тысячи клеток по их физическим и химическим свойствам.
Вот как это работает, от подготовки образца до получения результата, разбито на ключевые этапы.
1. Подготовка образца и формирование потока (Гидрофокусировка)
Клетки или частицы суспендируют в жидкости и вводят в прибор. Чтобы они проходили через лазерный луч строго по одной, используется явление гидродинамической фокусировки:
- Суспензия клеток подается через узкую иглу в центр быстрого потока жидкости (носителя).
- Носитель движется быстрее и сжимает центральный поток с клетками, выстраивая их в цепочку.
- В результате каждая клетка пересекает лазерный луч по отдельности.
2. Облучение лазером и рассеяние света
Когда лазерный луч (обычно синий или красный) попадает на клетку, свет рассеивается в разные стороны. Детекторы измеряют два основных типа рассеянного света:
| Параметр | Что измеряет | Что означает |
|---|---|---|
| FSC (Forward Scatter) — рассеяние вперед | Угол отклонения света до 20° | Пропорционален размеру клетки. Чем крупнее клетка, тем выше сигнал. |
| SSC (Side Scatter) — рассеяние вбок (под 90°) | Угол отклонения света на 90° | Пропорциональна внутренней сложности клетки (гранулярность, плотность ядра). Гранулоциты дают высокий SSC, лимфоциты — низкий. |
Первичный итог: По комбинации FSC и SSC можно идентифицировать разные популяции клеток в образце без окрашивания (например, отделить живые лимфоциты от мертвых клеток или гранулоцитов).
3. Детекция флуоресценции (самый важный этап для ваших реагентов)
Перед анализом клетки окрашивают флуоресцентными метками (например, вашими антителами к IgA/IgG, конъюгированными с HRP и флуорохромами).
Когда лазер возбуждает флуорохром, он испускает свет с большей длиной волны (другого цвета). Этот свет улавливается специальными детекторами (PMT — фотоэлектронные умножители).
- Если на поверхности клетки есть ваша мишень (например, IgA мыши), антитело с меткой связывается с ней.
- При прохождении через лазер клетка, несущая метку, дает яркий флуоресцентный сигнал.
- Важно: Современные цитометры могут одновременно измерять до 20–30 флуоресцентных параметров, что позволяет изучать сразу десяток маркеров на одной клетке.
4. Обработка сигнала (АЦП) и построение гистограмм
Аналоговый световой сигнал преобразуется в цифровой (оцифровывается). На этом этапе отсекаются «мусор» и двойные клетки (дублеты).
Данные визуализируются в виде:
- Гистограмм (для одного параметра, например, интенсивность флуоресценции — количество клеток).
- Точечных графиков (Scatter plots) — для сравнения двух параметров (например, FSC vs SSC или Флуоресценция 1 vs Флуоресценция 2).
5. Сортировка клеток (FACS — Fluorescence-Activated Cell Sorting)
Если цитометр оснащен сортирующим модулем (FACS), система создает капли жидкости, содержащие по одной клетке. Капля заряжается электрически в зависимости от сигнала клетки, затем пролетает через отклоняющие пластины и попадает в нужную пробирку (например, «GFP-положительные» в одну, «GFP-отрицательные» — в другую). Так можно выделить чистую популяцию для дальнейшего культивирования или анализа.
Если нужна помощь в подборе флуоресцентных аналогов этих антител для FACS — дайте нам знать, и мы поможем поискать их в каталоге.
