Принцип работы проточного цитомера

Шаг 1. Подача образца и «сужение» потока (Гидродинамическая фокусировка)

Главная проблема — клетки не должны проходить через луч скопом или хаотично. Чтобы этого избежать, используется жидкостная система:

• Образец (смесь клеток в буфере) подается через тонкую иглу в центр камеры (проточную кювету).
• Одновременно под давлением подается обтекающая жидкость (Sheath fluid).
• Обтекающая жидкость движется быстрее и «обжимает» центральный поток с клетками, сужая его до диаметра в 3–5 раз меньше диаметра самой клетки.
• Результат: Клетки выстраиваются в цепочку и вылетают из сопла строго одна за другой (это напоминает струйку воды из шланга).

Шаг 2. Пересечение лазерного луча (Оптическая система)

На выходе из сопла клетки встречают сфокусированный лазерный луч (обычно синий 488 нм, красный 635 нм или фиолетовый 405 нм). В точке пересечения с лучом происходит чудо — свет взаимодействует с клеткой и дает сразу несколько типов сигналов:

А. Сигналы рассеяния (без окраски)
Они дают базовую информацию о самой клетке:

• FSC (Forward Scatter) — свет, прошедший сквозь клетку и рассеявшийся вперед под малым углом. Этот сигнал пропорционален объему (размеру) клетки.
• SSC (Side Scatter) — свет, рассеянный клеткой вбок (под углом 90°). Этот сигнал зависит от гранулярности (плотности ядра, наличия гранул) и структуры цитоплазмы.

Б. Сигналы флуоресценции (если клетка окрашена)
Если клетка помечена флуоресцентными антителами (например, к IgA или IgG), лазер возбуждает их. Флуорохромы поглощают свет лазера и переизлучают его в виде света с большей длиной волны (другого цвета). Этот свет собирается специальными линзами и системой зеркал.

Шаг 3. Разделение света и фильтрация (Дихроичные зеркала и фильтры)

Одновременно от одной клетки может идти несколько видов флуоресценции (зеленая, оранжевая, красная). Чтобы их не перепутать, система оптики работает как «светофильтр»:

• Луч попадает на систему дихроичных зеркал (они отражают одни длины волн и пропускают другие).
• С помощью узкополосных фильтров для каждого детектора вырезается строго определенный диапазон света (например, только зеленый 530 нм). Благодаря этому прибор может параллельно регистрировать до 20–30 разных флуоресцентных каналов одновременно.

Шаг 4. Преобразование света в сигнал (Детекторы PMT)

Рассеянный и флуоресцентный свет попадает на фотоэлектронные умножители (PMT).

• Это сверхчувствительные датчики, которые превращают фотоны света в электрический импульс.
• Мощность PMT настолько велика, что прибор может «увидеть» сигнал даже от одной единственной молекулы флуорохрома на клетке.

Шаг 5. Оцифровка и фильтрация дублетов (Электроника и АЦП)

Аналоговый электрический сигнал поступает на Аналого-Цифровой Преобразователь (АЦП), который измеряет площадь (Area) и высоту (Height) импульса.

• Ключевой момент: Если через луч проходят две склеенные клетки (дублет), импульс будет слишком широким и высоким. Программное обеспечение сразу исключает такие события из анализа, чтобы не искажать статистику.

Шаг 6. Визуализация и анализ данных

Оцифрованные данные от каждой отдельной клетки (события) программа сохраняет и превращает в графики:

• Гистограмма: показывает распределение клеток по одному параметру (например, по яркости флуоресценции).
• Скаттер-плот (точечный график): показывает зависимость двух параметров. Самый популярный — FSC против SSC — позволяет сразу выделить популяции: лимфоциты, моноциты и гранулоциты (нейтрофилы) в чистой крови.

---

Шаг 7. Сортировка (FACS — если есть такая функция)

Если в цитометре есть функция сортировки, на выходе из сопла каждая клетка еще в струе жидкости разбивается на мельчайшие капли (с помощью пьезокристалла, создающего вибрацию).

• Капля, содержащая клетку с нужными параметрами, электрически заряжается.
• Пролетая через электростатическое поле, такие капли отклоняются в разные пробирки (плюс / минус). Так можно набрать чистую популяцию клеток для дальнейшего культивирования или ПЦР.

---

Короткое резюме «одним абзацем»:

Проточный цитометр — это конвейер: клетки по одной попадают под лазер; встроенные зеркала и фильтры раскладывают рассеянный свет и флуоресценцию по детекторам; компьютер переводит вспышки света в числа, рисует точки на графиках и (при необходимости) дает команду сортировщику отбраковать или сохранить конкретную клетку.